T h1 /T h2 細胞因子對心臟移植大鼠NPC 輸注誘導免疫耐受的作用
李玉僑, 孫立江, 張桂銘, 姚如永
(青島大學醫學院附屬醫院泌尿外科, 山東 青島  266003)

[  摘要]      目的  探討大鼠血清中 T h1/ T h2 細胞因子表達與供肝非實質細胞(N PC)輸注誘導心臟移植免疫耐受的關系。 方法 建立大鼠心臟移植模型, 將 40 只大鼠隨機分成排斥反應組、免疫耐受組, 每組 20 只。 觀察移植心臟存活時間, 并檢測受者血清中 T h1/ T h2 細胞因子白細胞介素 2(IL-2)、干擾素γ(IF N-γ)、白細胞介素 4(IL-4)、白細胞介素 6(IL-6)、白細胞介素 10(IL-10)的表達水平。 結果  免疫耐受組供心存活時間為(30 .83 ±2 .55)d , 排斥反應組為(8 .15±2 .08)d, 差異有顯著性(t =24 .46, P <0 .01)。術后 7 、14 d 排斥反應組血清 T h1 細胞因子 IL-2、 IFN-γ水平均高于免疫耐受組, T h2 細胞因子 I L-4、IL-10 表達水平均低于免疫耐受組, 術后7 d 血清 I L-6 表達水平顯著高于免疫耐受組(t =4 .50 ～  16 .20, P <0 .01)。 結論  免疫耐受的形成與 T h1/ T h2 細胞因子相互作用有關。
[  關鍵詞]      T h1 細胞;T h2 細胞;心臟移植;肝細胞;白細胞介素類;干擾素Ⅱ 型;免疫耐受
[  中圖分類號]      R654.28        [  文獻標志碼]      A        [  文章編號]      1672-4488(2011)05-0399-04
THE EFFECTS OF Th1/ Th2 CYTOKINES ON NPC-INFUSION-INDUCED IMMUNE TOLERANCE IN HEART-TRANSPLANTED
RATS    LI YU-QI AO ,  S U N  LI-J I A NG ,  Z H A NG GU I-MI NG ,  Y AO RU-Y O NG    (Department of  Urology ,  T he Affiliated  Hos- pital of Qingdao University  M edical Collage ,  Qingdao  266003 ,   Chin a)
[ ABSTRACT] Ob jective T o s tudy the relation ship betw een T h1/ Th 2 cy tokine expression in serum and im mune tolerance , induced by  non-parenchymal cells (N PC)of donated  liver ,  of cardiac allografts  in  rats.   Methods    A m odel of h eart t ransplant a- t ion  w as  created  in 40  rats ,  and evenly  randomiz ed to rejection  group and immu ne-t olerance group .T he su rvival t ime of th e im plan- ted heart w as ob served ,  the  exp ressions  of serum  Th1/ Th2  cy tokin es :in terferon-γ(IFN-γ),  interleukin-2 (IL-2),   interleu kin-4 (I L-4),  interleukin-6 (IL-6)and  interleu kin-10 (IL-10),  w ere measu red .   Results    T he survival t ime  of  heart allografts  in  tole rance group  was (30 .83 ±2 .55)d ,   and that in  rejection  g rou p w as (8 .15 ±2 .08)d ,   the  di ff erence being  significant  betw een  the tw o  groups (t =24 .46 , P <0 .01).Seven  and  14  days  after  t ran splantation ,   the expression  of  Th 1  cytokines (IL-2 ,   IFN-γ)w ere m uch  high er  in  rejection  group  th an  in  immu ne-t olerance g rou p ,  and  that  of T h2 cytokines (IL-4 ,  IL-10)w ere low er.Seven  day s after  surgery ,   th e exp ression  of  IL-6  in  rejection  group  w as  mu ch  higher  than  imm une-t olerance g rou p (t =4 .50 -16 .20,  P < 0 .01).Conclus ion     Th e formation  of immune  tolerance is associated w ith  interaction  of T h1/ Th 2 cy tokines.
[ KEY WORDS]     Th 1 cells ;T h 2 cells ;heart  t ransplan tation ;hepatocy te ;in terleu kins ;int erferon type  Ⅱ ;immu ne tolerance

隨著醫學診療技術的發展, qi官移植已成為終末期qi官衰竭病人的*治療方法, 而移植后免疫排斥反應阻礙了qi官移植廣泛開展。誘導機體抗原特異性免疫耐受, 是解決qi官移植排斥的根本方法。已有研究認為, Th1 與 Th2 兩類輔助性 T 細胞的相互作用與免疫耐受形成有關[ 1]  。本研究通過肝非實質細胞(N PC)誘導心臟移植免疫耐受的模型, 探討 Th1/ Th2 細胞因子在誘導免疫耐受中的作用。
1 材料與方法
1 .1 材料
實驗用 8 ～ 12 周齡、體質量為 200 ～ 250 g 的健

[ 收稿日期] 2011-01-16 ; [ 修訂日期] 2011-03-21
[ 作者簡介]   李玉僑(1985-), 男, 碩士研究生。
[ 通訊作者]   孫立江(1963-), 男, 博士, 主任醫師, 碩士生導師。
康封閉群雄性SD 大鼠及 Wistar 大鼠, 由青島派特福德白鼠養殖專業合作社提供, Lew is 大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。Collag enase Ⅱ 、蛋白酶 E 、D nase  Ⅰ 、二甲基亞砜(D MSO)購自 Sigm a 公司, RPM I 1640 及淋巴細胞分離液購自Solarbio 公司, 無支原體胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供, si裂霉素 C 由 Ro che 公司提供。大鼠白細胞介素 2(IL-2)、干擾素 γ(IFN- γ)、白細胞介素 4(IL-4)、白細胞介 6(I L-6)、白細胞介素 10(IL-10)試劑盒由上海恒遠生物科技有限公司提供。
1 .2    模型的建立及分組
SD 大鼠為供體, Wistar 大鼠為受體。頸部心臟移植模型建立具體方法參照文獻[ 2] 并進行改進。將供者心臟的主動脈與受者的頸總動脈、供者心臟
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的肺動脈與受者的頸外靜脈行端端吻合。供心血液循環途徑為:受體頸總動脈-供心主動脈-冠狀動脈- 冠狀靜脈-右心房-右心室-肺動脈-受體頸外靜脈 。手術成功標準:供心再灌注后顏色鮮紅, 收縮有力, 吻合口無滲血, 存活 72 h 以上。
將 40 只大鼠隨機分為排斥反應組(A 組)和免疫耐受組(B 組), 每組 20 只。術中及術后由于血栓形成 、窒息 、移植時間過長、移植心臟停搏等原因失敗5 只, 其中A 組2 只, B 組 3 只。A 組經尾靜脈注射生理鹽水 1 m L , 7 d 后行 SD ※Wistar 大鼠頸部心臟移植 ;B 組術前 7 d 經尾靜脈注射 Wistar 大鼠 NPC 2 ×10  個(1 m L)。
1 .3 NPC 懸液的制備
參照張燕華等[ 3] 所報道的方法。經門靜脈插管用 D-H anks 液原位灌注后無菌取下肝臟, 剪碎, Ⅱ 型膠原酶消化, 過 200 目鋼si網制成細胞懸液, 再以蛋白酶E 、D nase Ⅰ消化并離心, 用RPM I 1640 培養液清洗后獲得的細胞即為NPC 。錐蟲藍拒染法鑒定活細胞數>95   。
1 .4 檢測指標和方法
1 .4 .1    移植心臟平均存活時間(MS T)  移植心觸診判斷是否存活, 每日頸部心臟觸診, 記錄移植物存活和排斥反應發生的時間。以供心增大、停止搏動作為排斥反應的終點。存活時間從移植當天統計至 失活前 1 d 。
1 .4 .2    混合淋巴細胞反應(M LR)  輸注 NPC  7 d
后兩組各取大鼠 5 只, 分別測定其對供體大鼠及第三品系Lew is 大鼠的M LR 。A 組及B 組大鼠淋巴細胞為反應細胞, 供體及 Lew is 大鼠淋巴細胞為刺激細胞。
1 .4 .2 .1    供體淋巴細胞的制備  參照文獻[ 4-5]  ,
即從大鼠脾中分離出單個核細胞, si裂霉素C 處理后用含體積分數 0 .10 胎牛血清的 RPM I 1640 培養液調整細胞密度為 2 ×109 / L 。
1 .4 .2 .2    反應細胞的制備  從大鼠脾中分離出單個核細胞, 用含體積分數 0 .10 胎牛血清的 RPMI 1640 培養液調整細胞密度為 2 ×10 / L 。錐蟲藍染色鑒定細胞活率均>95    。
1 .4 .2 .3    混合淋巴細胞培養  參照文獻[ 4-5]  , 取
上述細胞各 50 μL   分別按如下分組加入 96 孔板, 置
37  ℃、體積分數 0 .05  CO 2   培養箱中培養 5  d 。1組:SD 大鼠單個核細胞 50 μL +A 組大鼠單個核細胞 50 μL ;2 組 :SD 大鼠單個核細胞 50 μL +B 組大
鼠單個核細胞 50 μL ;3 、4 組以 Lewis 大鼠單個核細胞作為刺激細胞, 每組設3 個復孔。終止培養前 4 h , 每孔加M TT  20 μL 。終止培養后, 吸棄培養液, 每孔加DMSO 150 μL , 待結晶*溶解后, 在酶標分析儀上測定 490 nm 處 A 值。以刺激指數(SI)判斷細胞活性高低 :SI =實驗孔 A 值/ 對照孔 A 值。
1 .4 .3    Th1/ Th2 細胞因子  心臟移植后 7 、14 d ,分別采集各組受體大鼠尾靜脈血, 采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清IL-2 、IF N-γ、I L-4 、IL-6 、I L-10 的水平。按試劑盒說明操作。
1.5    統計學處理
采用SPSS 17 .0 軟件進行統計學處理, 實驗數據以 x ±s 表示, 組間比較采用 t 檢驗。
2結 果
2 .1    M ST
A 組MS T 為(8 .15 ±2 .08)d , B 組為(30 .83 ±
2 .55)d , 兩組比較差異有顯著意義(t =24 .46 , P <
0 .01)。
2 .2    受者大鼠血清中 Th1/ Th2 細胞因子的表達
術后 7 、14 d , B 組血清中T h1 細胞因子I L-2 和IFN-γ表達水平較 A 組明顯下降, Th2 細胞因子IL-4 、IL-10 表達水平較A 組明顯上升, 術后 7 d 血清IL-6 表達水平較A 組明顯下降, 差異均有統計學意義(t =4 .50 ～ 16 .20 , P <0 .01)。見表 1 。
2.3    M LR
在NPC 輸注 7 d 后, B 組SI 值(3 .97 ±0 .33)較 A 組(7 .09 ±0 .25)顯著降低(t =17 .00 , P <0 .01);
第三品系Lew is 大鼠脾細胞作為刺激細胞時, B 組SI 值(7 .36 ±0 .31)與 A 組(7 .51 ±0 .70)比較差異無顯著性(t =0 .45 , P >0 .05)。
3討 論
供者特異性抗原能誘導受體產生免疫耐受并促進移植物存活已有較多報道[ 6-9] 。本實驗在未應用免疫抑制劑的情況下, 術前 7 d 給予受體大鼠尾靜脈輸注供體NPC 后, 行頸部心臟移植, 結果顯示, 免疫耐受組供心存活時間較免疫排斥組明顯延長, 說明NPC 成功誘導了免疫耐受, M LR 證實這種免疫耐受為供體特異性的。那么 NPC 是如何誘導免疫耐受的?
STA RZEL 等[ 10]  提出的“ 微嵌合體學說”和“ 雙
向移植排斥”理論,   可能是移植免疫耐受誘導和維持
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