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免疫磁珠方法分選細(xì)胞步驟

更新時(shí)間:2012-08-20   點(diǎn)擊次數(shù):16243次
用免疫磁珠做細(xì)胞分選(MACS)是簡(jiǎn)捷的免疫細(xì)胞及其它細(xì)胞的分離純化方法。 原理是已包被一抗的磁珠與細(xì)胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合,或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與細(xì)胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附于分離柱/試管上,實(shí)現(xiàn)…
 

用免疫磁珠做細(xì)胞分選(MACS)是簡(jiǎn)捷的免疫細(xì)胞及其它細(xì)胞的分離純化方法。
原理是已包被一抗的磁珠與細(xì)胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合,或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與細(xì)胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附于分離柱/試管上,實(shí)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞分離或陰性細(xì)胞的分離。本節(jié)介紹超微磁珠間接標(biāo)記、用分離柱陽(yáng)性分選細(xì)胞的方法。

Protocal:

1.離心收集待分離細(xì)胞,用少量PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTA PH7.2 PBS,真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體)充分混懸細(xì)胞(0.5ml/1×108細(xì)胞),加入一抗(10~20μg/ml終濃度),4° C孵育30分鐘。
2.用20倍體積PBE洗細(xì)胞一次,再加PBE(0.3ml/1×108細(xì)胞)充分混懸細(xì)胞后,加入相應(yīng)二抗包被的超微磁珠,混勻后置8~15° C孵育10~15分鐘。
3.將分離柱安裝入磁場(chǎng)中,加入0.5ml PBE,在重力作用下自然流盡,以預(yù)處理分離柱。

1.如果分離細(xì)胞用作培養(yǎng),全過(guò)程在超凈臺(tái)中完成。
2.超微磁珠及微小磁場(chǎng)系統(tǒng)適合于少量細(xì)胞分離(如106-107),通常已適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究;此外各公司尚有大磁珠及大磁場(chǎng)供應(yīng),可用于更大量細(xì)胞的分選;除分離柱外,也有試管及其它設(shè)備用于分選;根據(jù)我們應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn),分離柱由于提供了較大的接觸面,在細(xì)胞分選上具有較多優(yōu)點(diǎn)。磁場(chǎng)也可以自制,用一般的磁鐵即可做成簡(jiǎn)易磁場(chǎng),可提供足夠的磁力。
3.磁珠分離系統(tǒng)分離的細(xì)胞純度可以達(dá)到80~99%,得率在60~90%左右,僅次或相當(dāng)于流式細(xì)胞儀(FACS)的分選效率,與FACS 相比,MACS設(shè)備簡(jiǎn)單,耗時(shí)極短,故而應(yīng)用廣泛。MACS也可用做FACS分選前的預(yù)分離,以減少FACS所用時(shí)間。另外連續(xù)兩次過(guò)柱分選可進(jìn)一步提高分選細(xì)胞純度,通常可達(dá)95-99%。
4.在分離柱尾接上限速針頭,收集的流下的細(xì)胞即為陰性選擇細(xì)胞,一般純度低于陽(yáng)性選擇。
5.分離柱一般只能一次應(yīng)用,再用時(shí)降低分離效率;
6.分選下的細(xì)胞可用熒光標(biāo)記抗體(一抗或二抗)標(biāo)記后FACS鑒定純度;我們用熒光抗體直接標(biāo)記細(xì)胞后,用二抗包被磁珠分選出細(xì)胞,直接做FACS分析,也可實(shí)現(xiàn)分選和純度檢測(cè)。
7.陽(yáng)性選擇后,如需用第二種表面標(biāo)志繼續(xù)分離,可以用剪切酶剪切下之結(jié)合的磁珠和一抗,再次進(jìn)行下一輪分選。如需進(jìn)行細(xì)胞功能分析,也可經(jīng)培養(yǎng)12~24小時(shí),使結(jié)合的磁珠脫落后進(jìn)一步使用陽(yáng)選的細(xì)胞做研究。

分選的效率在很大程度上取決于實(shí)驗(yàn)者對(duì)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的把握。我們建議實(shí)驗(yàn)者在操作前認(rèn)真閱讀相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)及以下特別值得提出引起重視的有以下幾點(diǎn):
1.待分選細(xì)胞中如有貼壁細(xì)胞,建議在分選前先貼壁培養(yǎng)去除,或者提高EDTA濃度;
2.抗體包被磁珠對(duì)死細(xì)胞常有非特異性結(jié)合。因而分選前去除死細(xì)胞;
3.新鮮分離骨髓細(xì)胞,先用膠原酶、DNA酶、胰酶聯(lián)合消化,可使細(xì)胞團(tuán)塊解聚,從而提高分離效率。
4.上分離柱前,充分振蕩,混懸細(xì)胞,打散細(xì)胞團(tuán)塊;
5.用分離柱分選,應(yīng)用真空抽濾水,減少水中氣泡,使分離柱不被氣泡阻滯;
6.細(xì)胞懸液加入分離柱中時(shí),應(yīng)將滴管伸至底壁后加入,避免將細(xì)懸液沿管壁流入,使管壁殘流末分選細(xì)胞,以致后繼洗柱過(guò)程中,因疏忽末被洗下,zui后導(dǎo)致純度不高。洗柱時(shí),應(yīng)在前次液體充分流盡后,再加洗液。
7.分選細(xì)胞量應(yīng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)控制,不超量;
8.孵育時(shí)間和溫度應(yīng)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,延長(zhǎng)孵育時(shí)間、提高溫度會(huì)增加非特異結(jié)合;
9.先用抗體阻斷Fc受體,可降低非特異性結(jié)合;

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