纖維素酶活力測定實驗原理

纖維素酶是一種多組分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三種主要組分。其中C1酶的作用是將天然纖維素水解成無定形纖維素，CX酶的作用是將無定形纖維素繼續水解成纖維寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是將纖維寡糖水解成葡萄糖。纖維素酶水解纖維素產生的纖維二糖、 葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原，棕紅色的氨基化合物，在550nm波長處有zui大光吸收，在一定范圍內還原糖的量 與反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法測定其還原糖的量就可測定纖維素酶的活力。 酶活力也稱為酶活性，是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學反應的速度來表示，酶催化反應速度愈大，酶活力愈高， 反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反應的速度。酶促反應速度可用單位時間內、單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。在一般的酶促反應體系 中，底物往往是過量的，測定初速度時，底物減少量占總量的極少部分，不易準確檢測，而產物則是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準確測定。因此一般以測定 產物的增量來表示酶促反應速度較為合適。　　

纖維素酶活力測試探討

1 實驗方法
1．1 試驗藥品、設備
纖維素酶（DH一8405，DM一8637，德美化工），DNS試劑，冰醋酸，醋酸鈉，葡萄糖（分析純），濾紙（定性），羧甲基纖維素酶CMC（試劑 級），純棉針織半漂布 SPECT0RPH0T0METER VIS一723型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；HB一4CF型高溫試色機（XIAMEN RAPID CO．，LTD）。
1．2 試驗方法
1．2．1 酶活力測定方法
本實驗中酶活力的定義為1 gN體酶f或1 rnl液體酶），在50 度，pH=4．5條件下，1 h水解底物產生相當于1 mg葡萄糖的還原糖量為1個酶活力單位．以 u／g表示。
取適當酶液．分別以濾紙或CMC溶液為底物．于50℃ 恒溫水解反應．然后加入顯色劑DNS．沸水浴煮沸，加入蒸餾水，在540 nm測定吸光度值。
1．2．2 纖維素酶應用工藝和效果評定
纖維素酶用量為1．5 g／L，NN55 ℃ ，調節pH= 4．5，浴比1：10，處理時間45 min，得出減量率。將酶處理前后的試樣在105℃ 烘箱中烘至恒重。
其中減量率=[處理前織物干重一處理后織物干重）／處理前織物干重]xl00％
2 結果與討論
2．1 稀釋倍數影響（濾紙法）
DH一8405、、DM一8637稀釋倍數與酶活力的關系見表1、表2。

如以酶活力為y軸，以稀釋倍數為X軸作圖，所得曲線的擬合一元線性回歸方程為y=1．1226x+ 3422，R2=0．9890。

同樣好作酶活力（v）與稀釋倍數（x）的關系曲線．其擬合一元線性回歸方程為v=0．5023x+853．65， R2==0982。
由以上結果可知．稀釋倍數的改變會明顯改變酶活力測定的結果。在一定范圍內稀釋度大．酶活力結果偏高．稀釋度小．結果偏低．但是稀釋度過大．結果也有所降 低：另外．參考各類纖維素酶活力測定方法．用不同稀釋度的酶液對酶活力擬合一元線性回歸方程．可看出該線性相關區域較窄．且對于不同的酶存在不同的線性關 系．在此線性范圍內．由任一稀釋酶液得到的結果都可以推算得到酶液活力。當然這樣給測試帶來很多不便．平常測試中也可以規定吸光度的范圍．如以吸光度值 0．5左右酶活力定為100％．可看出在此值左右所測酶活力波動不大．相對較穩定。

2．2 底物選擇影晌
濾紙作為底物結構較為松散．可及區較多．是聚合度和結晶度都居中等的纖維性材料．容易同時被內切酶和外切酶降解．再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等還原糖，反 映的是纖維素酶三類酶組分的協同作用的總酶活：另外由于外切酶對纖維素鏈的專一性高，而內切酶的專一性較低．在降解CMC時．主要反映的是內切酶的活力 因此．酶對不同底物的活性是不同的．同一酶活測定方法獲得的幾種酶制劑的活力數值．在作用其它底物時僅能作為參考。本實驗中選用了濾紙和CMC兩種底物． 對DH一8405、DM一8637NJ種酶進行活力測試，其結果如表3
 
由3表可知，以CMC為底物測得的酶活力值比以濾紙為底物測得的酶活值高，即兩種酶的內切酶活力較高．且比總酶活還大，幾乎差一個數量級。可能是由于 CMC為水溶性底物，而濾紙與酶屬多相催化，所以反應的空問阻礙較大．也說明了吸附對酶的活性部位與纖維素的結合及催化均有很大影響。
纖維素酶的3組分．每種酶對纖維素的作用部位都不同．相互之間有協同性，即使是單一的酶對不同底物的活性也是不同的．同一酶活測定方法獲得的幾種酶制劑的活力數值．在作用其它底物時僅能作為參考。
2.3 酶活力與減量率關系
分別用DH一8405和DM一8637對白布進行食毛整理．得出平均減量率比值與酶活力之間關系．結果如表4所示。

表4可明顯看出織物的減量率與內切酶活力關系密切。說明織物的酶減量率受內切酶活力影響較大。
3 結論
（1）以濾紙為底物．用不同稀釋度的酶液對酶活力擬合一元線性回歸方程．可看出兩者之間存在較窄的線性關系，在此線性范圍內由任一稀釋酶液得到的結果都可以推算得到酶液活力．但各種酶其線性關系是不同的，在實際中為測試方便也可規定吸光度的范圍．減少酶活力測試誤差。
（2）底物不同，活力的測定值也不同．以羧甲基纖維素為底物測得的CMC酶活值比以濾紙為底物測得的FPA酶活值高；說明酶對水溶性底物有較高的活力；另外根據酶食毛效果看．CMC酶活更接近實際應用效果。

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